發(fā)布日期：2018-03-06

　　哈佛大學(xué)的化學(xué)生物學(xué)家David Liu領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)出一種稱為xCas9新酶，可更多更有效地修改基因組中的位點(diǎn)，進(jìn)而提高CRISPR-Cas9的效用，同時還可降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)。這項(xiàng)研究結(jié)果以《Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity》為題發(fā)表在2月28日的《Nature》上。

　　CRISPR靶向特異性是由兩部分決定的，一部分是RNA嵌合體和靶DNA之間的堿基配對能力，另一部分是Cas9蛋白對靶DNA的3'末端發(fā)現(xiàn)的被稱為protospacer adjacent motif（PAM）的DNA序列上的識別能力。

　　PAM通常由NGG三個堿基構(gòu)成（N為任意堿基）。

　　病毒入侵時，Cas1和Cas2編碼的蛋白將掃描這段外源DNA，并識別出PAM區(qū)域，然后將臨近PAM的DNA序列作為候選的原間隔序列。

　　隨后，Cas1/2蛋白復(fù)合物將原間隔序列從外源DNA中剪切下來，并在其他酶的協(xié)助下將原間隔序列插入臨近CRISPR序列前導(dǎo)區(qū)的下游。不同的Cas9的識別能力不同。

　　目前，最常用的實(shí)驗(yàn)Cas9是從化膿性鏈球菌中分離而來，稱為spCas9，其在具有32億個堿基對的人基因組中，大約僅能正確識別其中的1/16序列。這就是CRISPR-Cas9技術(shù)的真正局限性。

　　Liu及其研究團(tuán)隊(duì)對spCas9稍加改動，迫使spCas9在實(shí)驗(yàn)室中迅速擴(kuò)增，積累突變，再識別各種PAM序列并對臨近的DNA進(jìn)行切割。他們最終獲得了xCas9，其可更廣泛地識別不同的PAM，從而使得Cas9的識別能力增加了至少4倍。

　　研究人員對該酶進(jìn)行了測試，并將其與堿基編輯器組合，他們發(fā)現(xiàn)，改變后的xCas9的不僅提高了CRISPR-Cas9的效用，而且切割能力未受影響，甚至降低了脫靶風(fēng)險(xiǎn)，成功實(shí)現(xiàn)了雙贏。

連續(xù)進(jìn)化的Cas9具有更寬的PAM兼容性

演變后的xCas9在人細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄激活和基因組DNA切割

　　另一方面，加利福尼亞大學(xué)圣地亞哥分校的生物工程師Prashant Mali說，同樣的方法可以用來改變Cas9酶的其他變體，包括一些有希望用于基因治療的相對較小的Cas9蛋白質(zhì)。他說，那些蛋白質(zhì)往往具有更為嚴(yán)格的限制性PAM序列，若能成功應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)，對基因治療將是莫大福音！

　　加利福尼亞斯坦福大學(xué)的合成生物學(xué)家 Stanley Qi 稱這項(xiàng)工作“令人眼花繚亂”，并表示他的團(tuán)隊(duì)渴望在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用此項(xiàng)成果。xCas9具有更廣泛的PAM識別和更高的特異性，這足夠令科學(xué)家們興奮，但是，在徹底挖掘出這項(xiàng)技術(shù)的潛力前，仍需要進(jìn)行更多的測試。

　　參考文獻(xiàn)：

1.Powerful enzyme could make CRISPR gene-editing more versatile

2.Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity

來源：轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng)